文章来源：醉心科学微信公众号

　　继20名中外学者在Protein Cell杂志发表实验数据表明无法重复韩春雨的论文（以下简称韩论文）实验结果之后，发表NgAgo原始论文的Nature Biotechnology （自然生物技术，NBT）杂志也在几天前发表了一篇经过同行评议（peer reviewed）的名为“无法检测到DNA介导的NgAgo基因编辑”（“Failure to detect DNA-guided genome editing using Natronobacterium gregoryi Argonaute” ）的论文，作者分别来自于韩国、德国、以及美国的三个具有丰富基因编辑研究经验的研究组。杂志同时配发了“编辑部关注”，表示对于韩论文的可重复性的忧虑，同时表明会与原论文作者保持联系，在2017年一月底之前完成调查。众多媒体已经就“编辑部关注”进行了大量报道，在这里我给大家详细说明一下这篇重复NgAgo基因编辑失败的学术论文的实验设计和结果。

　　这三个研究组分别独立得进行了韩论文的重复实验，合成了文中使用的具有5’磷酸化的gDNA（guide DNA，在韩论文描述中可以介导NgAgo到目标基因位点进行编辑），使用韩提供给Addgene（质粒共享的平台）的NgAgo表达质粒，转染了韩论文中使用的细胞系，对于基因组DNA的编辑进行了检测。如果NgAgo发挥作用，它将在gDNA的介导下，定位在目标基因组位点并引发DNA的双链断裂，进而导致目标位点发生小片段DNA的插入或缺失突变（insertion and deletion， indel）。尽管多次尝试并试图优化条件，这三个研究组都无法检测到任何内源基因发生了NgAgo介导的突变。

　　首先Cathomen研究组试图重复韩论文中在Hela和293T细胞中利用NgAgo编辑质粒上的GFP（绿色荧光蛋白）基因，从而降低GFP表达的实验。尽管使用了同样的实验系统和步骤，使用了韩论文中使用的gDNA（G3、G4），Cathomen研究组未检测到显著的GFP降低。

　　图中表明的是质粒表达GFP的降低水平。可见使用CRISPR系统（Cas9）的样品中具有明显的GFP表达降低（约15倍），而NgAgo组无论是使用韩所提供的Addgene质粒（AgoN1）还是他们自己克隆的质粒（AgoN2），均未能检测到GFP降低。

　　他们进一步尝试编辑整合在基因组里面的GFP基因，同样未能发现GFP表达的显著降低。

　　Ekker研究组在HEK293、Hela和K562细胞中检验了NgAgo对于内源基因DYRK1A的编辑，使用了韩论文中使用的五条gDNA（G5、G6、G10、G12和G13）。在所有的样品中都没有检测到目标基因发生突变。

　　I部分标明这五条gDNA在目标基因上所处的位置。II部分是DNA的测序图，每一个颜色的峰表示一个DNA的碱基（红色T，绿色A，蓝色C，黑色G）。可见无论用那一条gDNA和NgAgo一起进行实验，测序结果都和普通未编辑的细胞一样，意味着没有基因编辑被检测到（ DNA序列未发生改变）。

　　Kim研究组针对韩论文中的四个内源基因位点（DYRK1A， EMX1， GATA4， and GRIN2B）都进行了编辑实验，并且尝试了用脂质体转染和电穿孔转染两种方法将NgAgo表达质粒和gDNA导入细胞中。 不同样品中的基因组目标位点被扩增出来并应用深度测序来确定其发生突变的频率。在所有的NgAgo样品中都未能检测到高于测序误差（0.1%）的目标位点DNA序列变化，而作为阳性对照的CRISPR样品（SpCas9， sgRNA）则检测出高效率的基因编辑。下图只挑选了两个位点的数据进行展示。

　　图中标明的是在293T细胞中分别用脂质体转染（红色柱状图）和电穿孔转染（绿色柱状图）导入质粒和gDNA的实验结果。最上面的两个样品是CRISPR的阳性控制组，显示质粒可以被有效的导入细胞发挥作用，CRISPR系统可以有效的在目标基因位点产生突变。下面的样品分别是使用他们自己克隆的NgAgo（cloned NgAgo 200ng）以及Addgene上面韩提供的质粒（Addgene NgAgo 200ng），结合不同gDNA共同转染的样品，均未能在目标位点检测到突变。

　　Kim研究组应用质谱分析技术确定了所使用得gDNA确实具有5‘磷酸化，并且应用荧光标记的gDNA和表达GFP的质粒确定了gDNA和NgAgo质粒被有效得转染进入细胞。其他的两个研究组也应用Western blot和RT-PCR手段确认了NgAgo在被转染细胞中的有效表达。

　　综合所有这些数据，这三个研究组的结论是“基于以上数据，我们的结论是，将NgAgo表达质粒和5’磷酸化的gDNA共同导入人类细胞系是无法得到韩论文中的突变效率的。”（“On the basis of the above data， we conclude that in conditions designed to replicate those in Gao et al.3， co-delivery of plasmid DNA encoding NgAgo and a 5?-phosphorylated single-strand gDNA alone is insufficient to induce gene editing at the indel frequencies in cultured human cells reported in the original study。”）

　　和之前发表在Protein Cell的论文一样，这一论文是对于韩论文的严格的重复实验。文章中确定了gDNA的5’磷酸化，gDNA和NgAgo表达质粒的有效转染，所以只剩下非常有限的变量来解释无法重复的原因了。避免细胞污染是这些实验室的基本操作规范，所以用污染来解释也是非常牵强的。而分布在世界各地的实验室都发生了细胞污染导致实验失败的可能性几乎为“0”。发表在Protein Cell和NBT的这两篇文章都得出了同样的结论，即按照韩论文中的条件无法得到NgAgo有效编辑内源基因的结果。

　　在NBT的“编辑部关注”中提到韩春雨和沈啸同意杂志就这一争议发表论文，那么希望他们能够以真正正面、积极、科学的态度来配合调查，尽快给出一个客观的解释，澄清事实。

　　（本文根据NBT发表的论文“Failure to detect DNA-guided genome editing using Natronobacterium gregoryi Argonaute”翻译整理）